Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава.
В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред.
Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на: 1) среды животного происхождения (исходные продукты - мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.); 2) среды растительного происхождения (исходные продукты - соя, горох, картофель, морковь и т.д.).
Некоторые продукты используют в натуральном виде (картофель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и растительные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).
Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические питательные среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединении.
По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.
Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.
Полужидкие и плотные питательные среды . Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.
Агар-агар (малайское желе) - полисахарид, продукт переработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80...86 ºС, затвердевает при 40 ºС. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5...2%, реже 3 %; полужидких - 0,3...0,7%.
Желатина - экстракт из тканей, содержащих много коллагена (кости, хрящи, сухожилия и т.д.). Желатиновый гель плавится при 25 °С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37...38 °С. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10...20 % желатины.
По целевому назначению различают общеупотребительные (основные), обогащенные, специальные, элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические питательные среды.
Общеупотребительные (основные) среды . Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.
В качестве исходных компонентов для приготовления основных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.
Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1: 2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-мар-левый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-мар-левыми пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.
Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °С и добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия до рН 7,8...8,0, встряхивают и добавляют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).
Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона и 0,5 % хлорида натрия, устанавли-
Рис. 32. Приготовление скошенного агара
вают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 "С 15...20 мин.
Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2...3 % промытого мелко нарезанного агар-агара, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде проверяют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значения (7,2...7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Профильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 20...30 мин. Чтобы получить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят) (рис. 32).
Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандартной чашки Петри (рис. 33) около 10 см, выпускают чашки меньшего и большего диаметров, а также одноразовые пластиковые. В
стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки наливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45...50 "С питательного агара, чашки помещают на горизонтальную поверхность до застывания агара.
Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25 % агара. Кипятят при помешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2...7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.
Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ добавляют 10...20% измельченной желатины, нагревают до расплавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2...7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин.
Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1:5 (1:8) до содержания аминного азота 120 мг%, добавляют 0,5% хлорида натрия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4...7,6, кипятят 15...20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °С 20...30 мин.
Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2 % агар-агара.
Предприятия биологической промышленности выпускают готовые питательные бульон и агар в виде сухого порошка.
Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки - 10,05, хлорид натрия - 4,95. Навеску порошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 ºС 20 мин (рН 7,3).
Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей - 12,0; агар- 12,5; хлорид натрия - 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при 120 "С 20 мин (рН 7,3).
Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т. д. Такие питательные среды получили название обогащенных.
Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному до 45...50°С стерильному питательному агару добавляют 5...10% стерильной дефибринирован-ной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, крупного рогатого скота, кролика). Для получения дефибринирован-ной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15...20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах.
Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания питательной среды.
Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогичным образом.
Растворы углеводов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5... 1 % к питательной среде.
Специальные среды . Так называют среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий. Например, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.
Среда Мак-Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0...7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4...5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °С 1 ч, на второй день при 85 °С 30 мин. Для контроля стерильности приготовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37...38 °С.
Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсе-на и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсена: раствор А: гидрофосфат натрия - 11,876 г, вода дистиллированная - 1000 мл; раствор Б: дигидрофосфат калия - 9,078 г, вода дистиллированная - 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм 20 мин. В каждую пробирку добавляют шесть-восемь капель стерильной инактивированной при 56 °С сыворотки кролика.
Элективные среды
(лат. electus - избранный). Это питательные
среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественный рост искомого микроорганизма и
(или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей
микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть
плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят
цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.
Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2...7,4, содержащему 5...7,5 % хлорида натрия, добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, перемешивают и разливают в чашки Петри.
Среда Шустовой предназначена для выделения сальмонелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10 % к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2 % раствора Люголя.
Среда Раппопорт предназначена для культивирования сальмонелл. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи, 1 % индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.
Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 "С 30 мин. Затем стерильно добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия - 50 г, дистиллированная вода - 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.
Среда Кауфмана - это среда обогащения для сальмонелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1: 1000, и 5 мл стерильной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин.
Казеиново-угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют гидролизат казеина - 20 мл, хлорид натрия - 5 г, хлорид калия - 0,2 г, хлорид кальция - 0,002 г, карбонат натрия - 0,4 г, хлорид магния - 0,025 г, гидрофосфат калия - 0,24 г, растворимый крахмал - 1 г, цистин - 0,01 г, агар -20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Перед употреблением в расплавленный агар (50 °С) добавляют 3 % дрожжевого экстракта и 0,2 % сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.
Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции могут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата.
К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.
Среды Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 г хлорида натрия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0...7,4, добавляют один из углеводов-субстратов (лактоза, глюкоза и т.д.), агар-агар (0,3...0,4 %), а затем 1мл индикатора Андрэдэ или 0,1мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °С 20 мин.
Выпускают сухие среды Гисса с индикатором BP - смесь водно-голубого с розоловой кислотой (готовые среды - полужидкой консистенции).
Плотные дифференциально-диагностические среды применяют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их состав нередко кроме известного субстрата входят вещества, придающие питательной среде селективные свойства.
Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу.
К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °С добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной кипяченой воды. В отдельных пробирках готовят: 2...3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-го водного раствора сульфата натрия.
В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, перемешивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, среда закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и колония микроорганизма, например эшерихий, приобретает красный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.
Среда Левина аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метилено-вым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2...7,4) добавляют 2 мл 0,5%-го водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 г дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин. Лактозу и дигидрофос-фат калия предварительно разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопо-зитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет.
Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпускают в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой основы входят: желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, йод, хлорид натрия, лактоза, нейтральный красный. Навеску порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розоватая. Колонии сальмонелл бесцветные, эшерихий - брусничного цвета.
Методы культивирования микроорганизмов. Наряду с общими принципами культивирование микроорганизмов различных физиологических групп имеет некоторые особенности Культивирование аэробных и факультативно-анаэробных бактерий. Плотные, жидкие или полужидкие питательные среды, засеянные чистыми культурами микроорганизмов или исследуемым материалом, помещают в термостаты (рис. 34), поддерживающие оптимальную для данного микроорганизма температуру. При температурах, превышающих верхнюю границу нормы, бактерии не только замедляют рост, но и быстро гибнут. При температуре ниже оптимальной скорость роста микроорганизма постепенно замедляется.
У мезофилов температурный оптимум находится в интервале 30...37 ºС, у психрофилов - 10... 15 ºС, у термофилов - 50...60 ºС.
Микроорганизмы в процессе культивирования на питательных средах при условии, что в среды не вносят дополнительные вещества, постепенно замедляют и затем прекращают свой рост из-за истощения питательного субстрата, изменения оптимальных значений биофизических показателей (рН, Eh и т.д.). Такое культивирование микроорганизмов называют периодическим. Если при этом жидкую питательную среду в процессе инкубирования посевов не перемешивают, то такой способ культивирования определяют как стационарный. При диагностических бактериологических исследованиях обычно используют именно такой способ культивирования. В биологической промышленности при производстве вакцин и других биопрепаратов, когда необходимо достичь максимального выхода бактериальной массы или экзотоксинов, применяют периодическое культивирование в жидких средах с их интенсивным перемешиванием.
При таких задачах аэробные бактерии культивируют в колбах, бутылях на шюттель-аппаратах с частотой колебания 150... 250 мин-1, что облегчает передачу бактериям кислорода и питательных компонентов.
Рис. 35. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов.
1 – вход воздуха; 2 – выход воздуха; 3 – отбойники; 4 – мешалка; 5 - барботер
Наиболее эффективное культивирование бактерий в жидких питательных средах с максимальным выходом биопродукта достигают в ферментерах. Ферментеры (реакторы) представляют собой металлические или стеклянные культуральные сосуды емкостью от 500 мл до 1000 л (рис. 35). При культивировании бактерий в ферментерах среду перемешивают специальными мешалками с одновременной подачей необходимого количества стерильного воздуха. Ферментеры конструируют как автономные системы с автоматической регуляцией температуры и рН среды. В ферментерах также осуществляют непрерывное (проточное) культивирование, при котором в отличие от периодической культуры автоматически в среду подаются свежие питательные компоненты со скоростью, равной удалению аналогичного объема выросшей культуры бактерий. Такое непрерывное культивирование в хорошо отрегулированной системе в принципе можно продолжать неограниченно долго.
Культивирование анаэробных бактерий. Облигатные анаэробы - бактерии, у которых энергетический и конструктивный метаболизм происходит без молекулярного кислорода 02. У таких микроорганизмов в процессе дыхания конечными акцепторами
электронов являются окись углерода (IV), ионы сульфата, фумарат и др. Кроме того, молекулярный кислород действует на многие анаэробы губительно. Например, строгие анаэробы погибают при незначительных концентрациях кислорода (бактероиды, фузобак-терии), умеренные анаэробы менее чувствительны (С. perfringens ), аэротолерантные анаэробы могут расти в условиях обычной атмосферы (молочнокислые бактерии). Большинство болезнетворных анаэробов относят к строгим или умеренным анаэробам. Для их культивирования используют специальные питательные среды и газовые смеси. Последними наполняют анаэростаты.
Необходимое условие роста облигатных анаэробов - не столько отсутствие молекулярного кислорода, сколько низкий ОКВП питательных сред. Резко восстановительных условий достигают, добавляя в среды редуцирующие (восстанавливающие) вещества и одновременно удаляя из них молекулярный кислород. В качестве редуцирующих веществ в питательные среды добавляют химические соединения, приведенные в таблице 1.
1. Восстанавливающие вещества для культивирования анаэробов
С этой же целью в питательные среды вносят вареные кусочки печени, мышц, мозга, кровяные сгустки, куриный яичный белок, зерна ржи. Считают, что в этих тканях сильное редуцирующее действие оказывают вещества, богатые SH-группами.
Для создания условий анаэробиоза питательные среды максимально освобождают от кислорода путем кипячения, а также пропуская через жидкие среды инертные газы или наслаивая на поверхность питательной среды вазелиновое масло для предотвращения контакта с кислородом воздуха.
Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта-Тароцци - традиционная среда для культивирования анаэробов. Ее основой служит печеночная вода, которую готовят путем кипячения в воде мелких кусочков говяжьей печени (соотношение 1:1). Печеночную воду смешивают с МПБ в соотношении 1:2, смесь кипятят, устанавливают необходимый рН и разливают в пробирки по 10 мл. В пробирки добавляют кусочки вареной печени (восстановитель) и затем вносят по 2 мл вазелинового масла. Автоклавируют при 0,5 атм 20 мин. Перед употреблением пробирки со средой кипятят в водяной бане, затем охлаждают и только после этого проводят посев.
Для выращивания анаэробов используют также питательные среды с повышенной вязкостью, поскольку диффузия кислорода в них затруднена.
Полужидкий агар: к МПБ добавляют 0,25...0,75 % агара, 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки высоким столбиком и дробно стерилизуют.
Практикуют культивирование анаэробов в толще плотных сред.
Сахарный агар в трубках Вейона: к 2%-му МПА добавляют 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4. Посевной материал вносят в расплавленную и охлажденную до 48...50 "С среду, перемешивают и разливают по стерильным узким стеклянным трубкам - трубкам Вейона (длина 20...25 см, диаметр 1...1,5 см). Концы трубок закрыты стерильными резиновыми пробками. Колонии анаэробов вырастают в толще питательной среды.
Широко применяют культивирование анаэробов на поверхности плотных питательных сред в чашках Петри.
Из числа плотных сред для культивирования анаэробов довольно часто используют кровяной агар с глюкозой и железо-сульфитный агар.
Глюкозо-кровяной агар: к 3%-му МПА (рН 7,2...7,4), расплавленному и охлажденному до 50°С, добавляют 1...2% стерильного раствора глюкозы, 15...20% дефибриниро-ванной крови барана и разливают по чашкам Петри.
Железо-сульфитный агар (среда Вильсон-Блера): к 100 мл 3%-го МПА (рН 7,4) с 1 % глюкозы при температуре 60 °С добавляют 10 мл 20%-го раствора сульфита натрия и 1мл 8%-го раствора хлорида железа, затем среду разливают по чашкам Петри. Анаэробы при росте на этой среде восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия, который реагирует с хлоридом железа, образуя черный осадок сульфита железа; колонии бактерий окрашены в черный цвет.
Для культивирования анаэробов на поверхности плотных питательных сред недостаточно добавления в них восстанавливающих агентов. Культуральные сосуды с посевами помещают в герметические камеры (анаэростаты), в которых тем или иным способом создают анаэробные (бескислородные) условия.
Обычный анаэростат представляет собой металлический цилиндр, который герметически закрывает крышка с резиновой прокладкой (рис. 36). На крышке размещены манометр и краны для откачивания воздуха или наполнения анаэростата инертным газом (азот). Воздух откачивают с помощью вакуумного насоса, закручивают вентиль и анаэростат с пробирками или чашками помещают в термостат. Обычное остаточное давление в анаэро-стате около 10 мм рт. ст. Созданы анаэростаты, удаление кислорода из которых происходит за счет его реакции с водородом в
присутствии катализатора (платиновый, палладиевый). Водород в камеру закачивают из баллона через редуктор. Некоторые анаэробные камеры снабжены нагревательными элементами с терморегулирующим устройством, обеспечивающим автономное поддержание температуры на необходимом уровне.
Культивирование микроаэрофильных бактерий. Хотя микроаэрофильные бактерии по типу дыхания аэробы, они растут не в обычной атмосфере (21 % кислорода), а с пониженным содержанием кислорода. Например, Campylobacter fetus растет в атмосфере, содержащей не более 6 % кислорода. Такую атмосферу можно создать в герметичных термостатах, анаэростатах, заменяя часть воздуха сжатым оксидом углерода (IV) из баллона, или в обычном эксикаторе. В последнем случае пробирки с посевами помещают в эксикатор вместе с бюксом, содержащим ватку, смоченную спиртом, или свечу. Вату (свечу) зажигают и закрывают крышку эксикатора. Пламя затухает по мере выгорания кислорода, и снижение его содержания достаточно для роста микроаэрофилов.
Наиболее доступен и эффективен способ культивирования микроаэрофилов в полужидкой среде с 0,1...0,4 % агара. В такой среде конвекционные потоки не способны перемешивать верхние, богатые кислородом слои среды с нижними, что создает в среде, заполняющей пробирку, градиент концентрации кислорода. Культуру микроаэрофила засевают уколом, и микроорганизм растет в зоне с оптимальным содержанием кислорода, обычно в виде тонких дисков на расстоянии от нескольких миллиметров до нескольких десятков миллиметров от поверхности среды.
Культивирование грибов. Лучший рост грибов отмечен на средах с содержанием углеводов 1...4%. При первичной изоляции для подавления роста различных сопутствующих бактерий в питательные среды часто добавляют антибиотики.
Агар Сабуро применяют для культивирования возбудителей дерматомикозов и кандидамикоза. Глюкоза -4 г, пептон - 1 г, агар - 1,8 г, дистиллированная вода - 100 мл. После растворения агара среду фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 6,9...7,0.
Агар Чапека используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 30 г, нитрат натрия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия - 0,5 г, сульфат железа -0,0012 г, агар -20 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Естественный рН среды 5,6...5,9. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.
Сусло-агар предназначен для культивирования возбудителей дерматомикозов и кандидамикоза. Солодовое неохме-ленное сусло разбавляют водопроводной водой в соотношении 1: 2 (до содержания Сахаров 7 %), устанавливают рН 6,5...6,7, добавляют 2 % агара, кипятят, фильтруют, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.
Агар Литмана пригоден для культивирования дерматофитов. Пептон - 10 г, глюкоза - 10 г, бычья желчь - 15 г, кристаллвиолет -0,01 г, агар -20 г, дистиллированная вода- 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 15 мин.
Среда Ван-Итерсона предназначена для выделения из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохиотоксикоз и др. Нитрат аммония - 0,5 г, дигидрофосфат калия - 0,5 г, водопроводная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 30 миц. Затем средой увлажняют стерильные чашки Петри с фильтровальной бумагой.
Жидкая среда Чапека. Глюкоза - 30г, нитрат натрия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - 0,001 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 5,9...6,2. Жидкую среду можно использовать для увлажнения фильтровальной бумаги в чашках Петри с целью последующего культивирования грибов.
Среда Билай предназначена для получения макроконидий грибов. Нитрат калия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния -0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - следы, крахмал растворимый - 0,1 г, сахароза - 0,1 г, глюкоза - 0,1 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Среду разливают по пробиркам по 5 мл и в каждую пробирку вставляют полоску фильтровальной бумаги таким образом, чтобы большая часть ее находилась над раствором. Среду стерилизуют при 1 атм 20 мин.
Глюкозный бульон Сабуро используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 40 г, пептон - Юг, дистиллированная вода- 1000мл. Нагревают до кипения, разливают по пробиркам и стерилизуют при 1 атм 15 мин.
Культивирование на волосах по Ван-брейзегему применяют при выделении дерматофитов. Здоровые стерильные волосы прикрепляют коллодием к стеклянной трубочке. На середину волос наносят культуру гриба. Трубочку помещают в цилиндр, на дно которого для влажности наливают небольшое количество воды. Культивируют при 25 "С пять-десять дней и более.
Для выделения возбудителей гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита применяют кровяной агар.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Приготовить скошенный МПА, сывороточный и кровяной
МПА.
2. Изучить устройство анаэростата и ферментера.
Контрольные вопросы
1.Какие общие требования предъявляют к питательным средам?
2.На какие группы классифицируют питательные среды?
Как культивируют анаэробы и микроаэрофилы
Питательные среды классифицируются по происхождению, консистенции, составу, целевому назначению.
А. По происхождению питательные среды делятся на естественные, искусственные, синтетические.
Естественными питательные среды называются в тех случаях, когда для выращивания микроорганизмов используются натуральные продукты (молоко, свернутая сыворотка и др.).
Искусственные питательные среды – это среды, которые готовятся по специальным прописям из различных продуктов, например, мясо-пептонный агар (МПА) или мясо-пептонный бульон (МПБ).
И естественные, и искусственные среды могут быть растительного (картофельная среда) или животного(молочные, мясные среды) происхождения.
Синтетическими питательными средами называются такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Синтетические среды используются, когда выращиваемую бактериальную клеточную массу необходимо освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных питательных сред.
Например, синтетические среды необходимы при получении бактериальных аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизмов. Преимущество таких питательных сред состоит в том, что они легко воспроизводимы, так как имеют постоянный состав.
Б. По консистенции различают питательные среды жидкие, полужидкие и плотные.
Жидкие среды готовят, используя экстракты, растворы, гидролизаты различных исходных продуктов. Таким образом, вещества, необходимые для питания бактерий, находятся в растворенном состоянии. (Примеры: МПБ, солевой бульон и др.).
Полужидкие среды готовятся на основе жидких с добавлением в их состав 0,2-1% агара-агара или другого уплотнителя. Уплотнители – вещества, придающие средам требуемую консистенцию. В качестве уплотнителя чаще всего используется агар-агар (по-малайски – желе) – это полисахарид - продукт переработки некоторых морских водорослей; он плавится при температуре 80-86 о С, а затвердевает при 40 о С). Желатина тоже является уплотнителем; она представляет собой экстракт из тканей, содержащих много коллагена (костной или хрящевой). Желатину добавляют в питательные среды в количестве 10-22%. Температура плавления желатины – 25 о С, что делает её неудобной для выращивания большинства микроорганизмов; оптимальная температура культивирования которых составляет 37 о С.
Кроме того, некоторые бактерии выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину.
Плотные питательные среды тоже готовятся на основе жидких, но содержащие агар-агара должно быть не менее 1,5-2%. (Примеры: МПА, сахарный агар).
Таким образом, консистенция питательных сред определяется количеством содержащихся в их составе агара-агара.
В. По составу питательные среды могут быть простыми и сложными.
Простые содержат минимальное количество компонентов (например: МПБ, МПА).
Сложные готовятся путём добавления к простым определённых дополнительных компонентов (крови, сыворотки, глюкозы и др.).
Г. По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективно-селективные, дифференциально-диагностические, транспортные.
К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий (примеры МПА, МПБ).
Элективно-селективные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определённого вида (или определённой группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При этом состав сред определяется биологическими особенностями, по которым данный микроорганизм отличается от большинства других. Компоненты таких питательных сред обеспечивают преимущественный рост искомых микроорганизмов и (или) подавление в той или иной степени рост сопутствующей микрофлоры.
По консистенции эти среды могут быть жидкими(например: 1% пептонная вода для выделения холерного вибриона) или твёрдыми (желточно-солевой агар для выделения стафилококков).
Дифференциально-диагностические среды предназначены для разграничения отдельных видов или типов микроорганизмов.
Состав таких питательных сред основан на том, что отдельные виды (или типы) бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.
В состав таких сред входит обычно:
питательная основа (МПБ или МПА), обеспечивающая рост изучаемых микроорганизмов;
субстат, выявляющий наличие ферментов (например, лактоза, глюкоза);
индикатор. Индикаторы – это вещества, меняющие свой цвет в зависимости от рН среды. Их используют не только для определения кислотности среды, но и вводят в состав питательной среды для выявления биохимических свойств микробов.
Изменение цвета среды указывает на образование кислоты или щёлочи в результате ферментативной деятельности микробов (например: индикатор Андреде в кислой среде имеет красную окраску, при нейтральном значении рН-бесцветную; аналогичным образом действует индикатор фуксин).
Примеры дифференциально-диагностических сред: среда Эндо, позволяющая отличать лактозоположительные и лактозоотрицательные энтеробактерии; жидкая среда Раппопорт, выявляющая различия тифозных и паратифозных бактерий и многие другие.
Выделяют транспортные среды (консервирующие) , которые используются для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. Они предотвращают отмирание патогенных микроорганизмов и способствуют подавлению сапрофитов. К этой группе относятся: глицериновая смесь, глицериновый консервант с солями лития и др.
Приведённая классификация в большой степени условна, так как некоторые среды могут быть одновременно и дифференциально-диагностическими, и селективными (например, среда Плоскирева, ЖСА и другие).
В настоящее время в лабораторной практике часто используются сухие питательные среды, которые выпускаются в виде полуфабрикатов. Для их производства используется рентабельное непищевое сырьё, отходы мясной и рыбной промышленности. Применение сухих сред избавляет лаборатории от трудоёмкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сопоставимые результаты в разных лабораториях и приближает к разрешению вопроса о стандартизации питательных сред. Технология приготовления таких сред проста, она указана на этикетке. Сухие питательные среды удобны в транспортировке и хранении.
Питательные среды в микробиологии - это субстраты, на которых выращивают микроорганизмы и тканевые культуры. Они применяются для диагностических задач, выделения и изучения чистых культур микроорганизмов, получения вакцин и лекарств, для других биологических, фармацевтических и медицинских целей.
Классификация микробиологических питательных сред
В микробиологии питательные среды разделяют на:
- среды определенного и неопределенного состава;
- натуральные, полусинтетические и синтетические;
- основные, диагностические, элективные;
- плотные, полужидкие, жидкие, сухие, сыпучие.
Натуральными питательными средами называют те, что получают из природных материалов: крови, мяса, белков, органов животных, растительных экстрактов и растительного сырья. Примером таких сред могут быть мясной бульон, молочная сыворотка, пивное сусло, настои сена, агар-агар , кровь, желчь. Натуральные среды относятся к средам с неопределенным составом, который в разное время могут иметь разное количество тех или иных компонентов.
Полусинтетические среды тоже считаются средами с неопределенным составом. Они готовятся на основе натуральных питательных сред, но в них добавляются вещества, которые гарантируют культурам активное размножение. На полусинтетических средах выращивают культуры для получения витаминов, аминокислот, антибиотиков в промышленной фармацевтике.
Синтетические среды готовят из ингредиентов известного состава, в известной концентрации и соотношениях, поэтому эти среды относятся к средам определенного состава. С их помощью изучают метаболизм микроорганизмов, их биологические и физиологические свойства, возможность получения веществ, подавляющих или, наоборот, стимулирующих их развитие.
Основные, элективные и диагностические питательные среды
Основные среды служат для выращивания различных микробных культур, а также как основа для получения элективных и диагностических сред. К основным средам, например, относится мясной бульон, мясной агар, сусло, бульон Хоттингера. Для разных культур в основные среды добавляют некоторые компоненты для стимулирования роста - это могут быть витамины, аминокислоты, природные экстракты. Так, возбудитель коклюша выращивается на среде с добавлением крови.
Элективные среды - среды для избирательного (селективного) выращивания биологических культур. Состав среды подбирается так, чтобы быть оптимальным для одного вида или группы близкородственных бактерий и подавлять развитие бактерий других видов. Например, добавление в среду хлористого натрия в определенной концентрации подавляет рост всех бактерий, кроме стафилококков. С помощью элективных культур получают чистые культуры для дальнейшего размножения и накопления.
Диагностические среды служат для идентификации микроорганизмов. По изменению среды и ее химического состава (изменению окраски среды, появлению пузырьков газа и т.п.) определяют вид бактерий. В такие среды часто добавляют химические красители-индикаторы, такие как кристаллический фиолетовый , малахитовый зеленый, метиленовый синий , фусин и другие. Они помогают разделить близкие культуры. Скажем, в розовой среде Эндо, подкрашенной фусином, кишечная палочка образует колонии красного цвета, а тифозные и дизентерийные колонии бактерий - бесцветные.
МГАВМиБ им. К.И. Скрябина
Кафедра микробиологии и
иммунологии
Руководитель Бурлакова Г.И.
Р Е Ф Е Р А Т
Питательные среды и их классификация
Выполнен студенткой
II курса 1-й группы ФВМ
Куринновой С.В.
Москва-2007 г.
1. Введение……………………………………………………………….2
2. Культивирование микроорганизмов………………………………...2
3. Классификация питательных сред и способы их получения………3
4. Культивирование грибов……………………………………………..7
5. Вывод…………………………………………………………………..8
6. Список использованной литературы…………………………………9
1. Введение.
Микробы, как любые другие живые организмы свое развитие и рост, обновление строительного материала, обеспечение энергетических процессов осуществляют за счёт постоянного обмена веществ с окружающей его внешней средой, т.е. путём питания и дыхания. В зависимости от типа питания микробы подразделяют на аутотрофы (способные усваивать углерод из СО 2 , а также молекулярный азот из воздуха, а минеральные вещества путём хемо- или фотосинтеза) и гетеротрофы (способны усваивать углерод и другие вещества только из готовых органических соединений). К аутотрофам относятся в основном многие почвенные бактерии, к гетеротрофам (параторофам) – микробы инфекционных болезней животных и растений.
Типы питания, дыхания (аэробы и анаэробы), индукцию и активность ферментов, токсинов, пигментов, рост и размножение являются основными физиологическими параметрами, которые учитывают при разработке составов питательных сред и условий культивирования микробов invitro.
2. Культивирование микроорганизмов .
Культивировать микроорганизмы – это значит искусственно создавать условия для их роста и размножения invitro, взаимосвязанных, но не обязательно сопряжённых процесса. Рост и размножение –циклический 4-х фазный процесс (латентная, логарифмического роста, стационарная, гибель). Период между образованием новых клеток и их делением называется периодом генерации, на длительность которого, кроме особенностей микроба, влияет состав питательной среды. Формы колоний разных микробов на питательной среде одного и того же состава отличаются, что учитывают при их дифференциации.
Для культивирования invitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы могут использовать в качестве питательных веществ для своего роста и размножения. Такие питательные субстраты – плотные или жидкие – называют культуральными или питательным средами. В большинстве случаев в микробиологических лабораториях микроорганизмы культивируют invitro, т.е. в стеклянных колбах, пробирках и других сосудах.
К любой питательной среде предъявляют ряд основных требований:
1). Стерильность и по возможности прозрачность.
2). При составлении питательных сред учитывают потребность микроорганизмов в элементах питания (необходимые для жизнедеятельности клеток биохимические факторы – источники энергии, С, N, S, а также неорганические ионы – доступные для усвоения микроорганизмами).
3). Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (pH), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (a w ), осмотического давления.
3. Классификация питательных сред и способы их получения.
В зависимости от видовой принадлежности микробов и целей культивирования консистенция и составы культуральных сред бывают разными и варьируют в широких пределах. Среда, отвечающая биологическим особенностям микроба и обеспечивающая его рост и размножение, называется полноценной, не имеющая какого- либо компонента, необходимого для его жизнедеятельности – дефицитной .
Питательные среды классифицируют в зависимости от:
Химического состава и исходных компонентов;
Консистенции;
· целевого назначения.
В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред:
- среды неопределенного химического состава (естественные или натуральные среды) – это среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие сложный неопределенный химических состав:
1) среды животного происхождения (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.)
2) среды растительного происхождения (исходные продукты – соя, горох, картофель, морковь и т.д.)
На естественных средах хорошо развиваются микроорганизмы, однако эти среды малопригодны для контролируемого изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов и диагностических исследований, поскольку они не позволяют учитывать потребности ряда компонентов среды, а с другой стороны определять вещества, образующие микроорганизмами. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.
«Полусинтетические» среды (гидролизатные), относящиеся к средам с неопределенным составом. В них, наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества неопределенного состава. Их используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (продукты гидролиза мяса, молока, дрожжей, крови и др. белковых веществ).
Среды известного химического состава (синтетические) – в их состав включают известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т.д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические среды по составу бывают простыми или имеют относительно большой набор компонентов. Их используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединение. Кроме того, исследователи стремятся определить для каждого микроорганизма минимальные потребности в питательных веществах и, исходя из этого, создать минимальную среду, содержащую лишь необходимы для его размножения химические соединения.
По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.
Жидкие питательные среды . Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.
Полужидкие и плотные питательные среды. Используют для учёта количества бактерий, выделения их в виде «чистой» культуры и других целей. Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей -агар-агар или желатину.
Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным количеством азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5-2%,полужидких –0,3-0,7%.
Желатина – кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для применения.
По целевому назначению различают:
А).Общеупотребительные (основные) среды.
Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.
Мясная вода: Получение – мясной фарш заливают водопроводной водой 1:2, кипятят 1ч., затем фильтруют, доливают водой до первоначального объема, разливают по емкостям, плотно закрывают и стерилизуют автоклавированием при 120 О С 20 мин.
Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия нарезают, заливают кипящей водой 1:2, кипятят, охлаждают до 45 О С, добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия, встряхивают, добавляют хлороформ, закрывают и выдерживают в теплом месте 10 дней.
Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления используют мясной бульон. К 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г NaCI для создания осмотической активности. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды. Кипятят. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют автоклавированием при 120 0 С 20 мин.
Мясо–пептонный агар (МПА): к 1 л МПБ добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара, устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na 2 CO 3 , фильтруют и через воронки разливают в пробирки, стерилизуют автоклавированием при120 0 20 мин.
Мясо-пептонная желатина (МПЖ). К 1 литру МПБ добавляют желатин до конечной концентрации 10-20%, нагревают, устанавливают слабо-щелочную pH, кипятят, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром 3 дня или однократно автоклавированием при 120 0 С при 1 атм. течение 20 мин.
Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара, кипятят до его расплавления, устанавливают требуемую pH, фильтруют в горячем виде и стерилизуют автоклавированием.
Бульон Хоттингера : основной перевар Хоттингера разводят водой 1:5 (1:8), добавляют 0,5% NaСI, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают pH, кипятят 150-20 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют автоклавированием при 120 0 20 мин.
Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2% агар-агара.
Питательный бульон содержит: триптический гидролизат кильки –10,05, NaCI- 4,95. 15 г порошка этого бульона растворяют а 1 л дист. Воды, кипятят 2 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют а автоклаве при 120 0 С 20 мин (Ph 7,3).
По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории.
Универсальные - среды, на которых хорошо растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. К ним относятся: мясо-пептонный бульон (МПБ = мясная вода + 1% пептона + 0,5% NaCl), мясо-пептонный агар (МПА = МПБ + 2-3% агара).
Дифференциально-диагностические - среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и многие др.
Селективные (синонимы: избирательные, элективные, обогатительные) - среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и не благоприятствующие или даже препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий. Сюда относятся среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт, 1%-ная пептонная вода и др.
Дифференциально-селективные - среды, сочетающие в себе свойства дифференциально-диагностических и селективных сред. Они используются, в частности, для ускорения обнаружения и идентификации бактерий, относящихся к большому числу широко распространенных видов энтеробактерий и псевдомонад (среды Сиволодского).
Специальные - среды, специально приготовленные для получения роста тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. К ним относятся среды Мак-Коя-Чепина (для получения роста возбудителя туляремии), кровяной МПА (для получения роста патогенных стрептококков), среда Левенштейна-Иенсена (для выделения возбудителя туберкулеза) и др.
Синтетические - среды строго определенного химического состава, представляющие собой растворы неорганических солей с добавлением химических соединений, которые служат источником углерода или азота. Примером такой синтетической среды является минимальная среда М-9, в которой источником энергии и углерода является глюкоза, а азота - NH4C1. Синтетические среды могут быть и более сложного состава с включением различных аминокислот, оснований и витаминов.
Полусинтетические - синтетические среды, к которым добавляют какой-либо продукт природного происхождения, например сыворотку крови. Существует много различных вариантов питательных сред, сконструированных с учетом потребностей соответствующих видов бактерий и диагностических целей.
Асинхронный электродвигатель а4 предназначен для привода механизмов, которые не требуют регулировки частоты вращения (вентиляторов, дымососов, насосов). Отличительные особенности двигателей серии А4 и их характеристики вы можете узнать на